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      [飼料] 枯草芽孢桿菌發(fā)酵探討

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      發(fā)表于 2019-4-29 11:19:08 | 只看該作者 |只看大圖 回帖獎勵 |倒序瀏覽 |閱讀模式


      枯草芽孢桿菌是我國農業(yè)部允許作為飼料添加劑的兩種芽孢桿菌之一,已被越來(lái)越多地研制成飼用微生態(tài)制劑。因其制劑是無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)污染的“綠色”添加劑,故具有廣闊的發(fā)展前景,并已在畜牧業(yè)、飼料業(yè)廣泛應用,顯示巨大的社會(huì )效益和生態(tài)效益?莶菅挎邨U菌具有很強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等活性,能產(chǎn)生抗菌素,在動(dòng)物腸道內具有較強生物奪氧能力。這些特性對促進(jìn)動(dòng)物營(yíng)養的消化吸收、提高動(dòng)物的飼料轉化率、防病和促進(jìn)生長(cháng)起到重要作用。鑒于此,國內外專(zhuān)家學(xué)者對研究開(kāi)發(fā)枯草芽孢桿菌制劑用于畜禽養殖日趨關(guān)注,從而也促進(jìn)了這一產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展,但在現階段的工業(yè)化生產(chǎn)中,存在著(zhù)制約枯草芽孢桿菌發(fā)酵的諸多因素。

      1、枯草芽孢桿菌的生物學(xué)特點(diǎn)

      桿菌:一般(0.7~0.8)×(2.0~3.0)μm,電子顯微鏡測量為(0.5~0.6)×(1.1~3.5)μm,革蘭氏陽(yáng)性,運動(dòng),有長(cháng)而又豐富的周生鞭毛。

      芽孢:橢圓形,中生或偏中生,即使孢囊膨大也不顯著(zhù)。

      生長(cháng)溫度:最高溫度45~55℃;最低溫度5~20℃。

      陽(yáng)性反應:接觸酶;V-P反應;在7%的氯化鈉中生長(cháng);pH5.7生長(cháng);分解葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產(chǎn)酸;水解淀粉;利用檸檬酸作為碳源;還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;分解酪素;石蕊牛奶產(chǎn)堿胨化。

      陰性反應:厭氧生長(cháng);卵黃反應:在葡萄糖洋菜上或酪氨酸洋菜上形成可溶性黑色素;28℃4星期水解馬尿酸鹽;利用丙酸鹽并分解酪氨酸。在55℃生長(cháng)的菌株被0.02%的疊氮化合物抑制。

      變化的性質(zhì):在V-P液中產(chǎn)酸(pH5.0~8.0);對溶菌酶的抗性;在10%的氯化鈉中生長(cháng)。

      2、芽孢桿菌制劑的作用機理

      2.1可產(chǎn)生酶類(lèi)和營(yíng)養物質(zhì)

      研究表明芽孢桿菌能夠分泌大量的胞外酶,如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等,有助動(dòng)物對飼料的降解、消化,提高飼料利用率。飼料中未被消化的蛋白質(zhì)和一些含氮物質(zhì)在腸道中被大腸桿菌和其他細菌脫梭生成具有潛在的毒性的腐胺、吲哚、酚類(lèi)等物質(zhì)。一些芽孢桿菌可產(chǎn)生氨基氧化、SOD酶、分解硫化氫的酶以及其他抗菌物質(zhì)如過(guò)氧化氫,起到殺菌作用,從而減少動(dòng)物體內有害物質(zhì)的產(chǎn)生。研究表明一些芽孢桿菌產(chǎn)生SOD酶,SOD可以清除生物體內活性氧自由基,減少其對細胞的毒害作用,使生物   體免受傷害。芽孢桿菌在生長(cháng)繁殖過(guò)程中可以產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸,如乙酸、丙酸、丁酸等,一些脂肪酸可降低動(dòng)物腸道的pH,從而為乳酸菌的生長(cháng)創(chuàng )造條件,并且抑制病菌的生長(cháng)。其中丙酸還可以參與三梭酸循環(huán),為動(dòng)物的新陳代謝提供能量。同時(shí),能夠產(chǎn)生很高的維生素B和維生素C,為動(dòng)物提供維生素營(yíng)養。1996年Ozols對106株腸道菌進(jìn)行研究發(fā)現芽孢桿菌是維生素Bl和維生素B6的主要生產(chǎn)者;1998年倪學(xué)勤等研究表明芽孢桿菌產(chǎn)生有機酸為機體提供能量營(yíng)養的同時(shí),還促進(jìn)動(dòng)物對鈣、磷、鐵的吸收利用。

      2.2生物奪氧與生物拮抗作用

      腸道原籍菌群是腸道的優(yōu)勢菌,大多厭氧,而致病菌多為需氧菌。人為引入的益生芽孢桿菌在腸道定植后,消耗大量的游離氧,造成厭氧環(huán)境,可減少需氧菌對腸道的定植,并有利于乳酸桿菌和雙歧桿菌等厭氧菌的生長(cháng),致使體內的有益菌增加而致病菌減少,保持腸道微生態(tài)系統平衡。芽孢桿菌與有害菌競爭基本營(yíng)養物質(zhì)和腸道等黏膜結合位點(diǎn),抑制有害菌從而減少腸道疾病,提高機體抗病能力。

      2.3提高機體的免疫能力

      近年來(lái)研究表明,芽孢桿菌能分泌活性抗菌物質(zhì),使腸道相關(guān)淋巴組織處于高度反應狀態(tài)。同時(shí)T、B淋巴細胞的數量增多,動(dòng)物體液和細胞免疫水平提高。1992年Jonsson等報道,芽孢桿菌分泌胞外酶系的同時(shí)還產(chǎn)生抗生素。

      3、芽孢桿菌飼料添加劑的應用優(yōu)勢

      乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌作為益生菌的3種主要菌種來(lái)源,各自具有不同的生物學(xué)特性,在生產(chǎn)上也是各有不同。相對于另外兩種微生物,尤其是應用最為廣泛的乳酸桿菌,芽孢桿菌具有獨特的優(yōu)勢,主要體現在以下三個(gè)方面。

      3.1安全性很多種類(lèi)芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物已廣泛應用于食品、飼料中,目前尚未發(fā)現毒副作用,是一種安全的菌種。許多芽孢桿菌及其代謝物很早就被人們有意無(wú)意地在食品、醫藥和飼料中使用,一些芽孢桿菌屬于“公認安全(GRAs)”的菌種,芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的多種酶,如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶已在食品與飼料中廣泛應用。芽孢桿菌作為益生菌對動(dòng)物無(wú)毒害,生產(chǎn)出的肉蛋類(lèi)食品也是安全的。

      3.2代謝速度快芽孢桿菌易于分離、培養與保存,一般對營(yíng)養要求比較簡(jiǎn)單,代謝速度比較快,對于工業(yè)生產(chǎn)的要求不高。另外芽孢對熱、紫外線(xiàn)、電離輻射和某些化學(xué)藥品有很強的抗性,可忍受不良環(huán)境,比如可以在pH酸性環(huán)境生存,也可以在溫度高達80℃甚至更高的環(huán)境中生長(cháng)。

      3.3分子加工操作簡(jiǎn)便目前芽孢桿菌的分子生物學(xué)研究已比較深入,可以利用分子生物學(xué)工具和知識研發(fā)高產(chǎn)性能的菌種,提高微生態(tài)制劑的飼喂效果,比如可以把蛋白酶、木聚糖酶的基因轉移到芽孢桿菌中進(jìn)行表達等,更大程度地發(fā)揮芽孢桿菌的益生作用。

      4、枯草芽孢桿菌發(fā)酵研究

      所謂發(fā)酵,是借助微生物大量生成積累特定的代謝產(chǎn)物的現象。發(fā)酵工程是指采用現代工程技術(shù)手段,利用微生物的某些特定功能,為人類(lèi)生產(chǎn)有用的產(chǎn)品,或直接把微生物應用于工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程的一種新技術(shù)。發(fā)酵工程的內容包括菌種的選育、培養基的配制。滅菌、擴大培養和接種、發(fā)酵過(guò)程和產(chǎn)品的分離提純等方面。

      早在1975年,美國用蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensisBerliner)發(fā)酵制各種殺蟲(chóng)劑,以后各種芽孢桿菌被應用進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)各種產(chǎn)物。如應用地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶;利用耐堿性芽孢桿菌制備堿性淀粉酶;以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶、木聚糖酶、D-核糖、A-乙酰乳酸脫羧酶、B2甘露聚糖酶、肌苷、堿性果膠裂解酶?莶菅挎邨U菌可以以?xún)壬挎叩男问桨l(fā)揮其功能。當前,研究人員已經(jīng)開(kāi)始對以芽孢作為發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵體系進(jìn)行摸索和優(yōu)化。張根偉等對發(fā)酵培養基的組分和其他發(fā)酵條件進(jìn)行研究構建了枯草芽孢桿菌BS-6的液體發(fā)酵體系,使該菌的最后發(fā)酵水平為1.66×109CFU/mL?紤]到發(fā)酵培養基原料成本及獲得途徑便利等因素,麩皮、玉米粉、豆米粉等材料已經(jīng)用于該類(lèi)細菌的發(fā)酵生產(chǎn),并獲得較高的芽孢產(chǎn)量。

      4.1影響芽孢桿菌發(fā)酵的因素芽孢桿菌產(chǎn)生的對熱、紫外線(xiàn)、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有強抗性的芽孢,可忍受各種不良環(huán)境,能防治多種植物病害,易定殖在植物表面。其芽孢可以制成粉劑、可濕性粉劑等各種劑型的生防制劑而應用于農業(yè)生產(chǎn),此制劑具有與化學(xué)農藥混用而不失活的特性。因此,有必要對芽孢桿菌的產(chǎn)孢特性進(jìn)行研究,以期獲得最佳產(chǎn)孢條件,最終獲得商品化芽孢制劑。微生物發(fā)酵的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能,而且要提供合適的發(fā)酵條件,才能使它的生產(chǎn)能力充分發(fā)揮出來(lái)。優(yōu)化發(fā)酵工藝可以充分發(fā)揮菌種的潛在能力,提高發(fā)酵過(guò)程的生產(chǎn)效率,降低生產(chǎn)成本。因此,工藝優(yōu)化的研究尤其重要。

      發(fā)酵工藝的研究可從以下兩方面入手:(1)培養基組分的影響:包括碳源、氮源、維生素和輔酶、無(wú)機鹽及微量元素等。

      (2)發(fā)酵條件的影響:包括溫度、初始pH、初始接種量、裝液量、轉速等。

      4.1.1 培養基對發(fā)酵的影響

      培養基是人們提供微生物生長(cháng)繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養物質(zhì)的混合物。培養基的組成對菌體生長(cháng)繁殖、產(chǎn)物的生物合成、產(chǎn)品的分離精制乃至產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量都有重要影響。發(fā)酵工藝可分為斜面種子培養、種子擴大培養、發(fā)酵罐內菌體培養、和產(chǎn)物合成等幾個(gè)培養過(guò)程。種子培養基是供菌體生長(cháng)繁殖用的,營(yíng)養成分應是易被菌體吸收利用,比較豐富和完整,其中氮源和維生素的含量應略高些,但總濃度略低為宜,以便菌體的生長(cháng)繁殖。發(fā)酵培養基是供菌體生長(cháng)繁殖和合成大量代謝產(chǎn)物用的。發(fā)酵培養基的組成要考慮菌體在發(fā)酵過(guò)程中的各種生化代謝的協(xié)調,在產(chǎn)物合成期,使發(fā)酵液的pH不出現大的波動(dòng)。采用的原材料質(zhì)量相對穩定,同時(shí)不影響產(chǎn)品的分離精制,不影響產(chǎn)品的質(zhì)量。每個(gè)過(guò)程都有其培養基組成和制備工藝條件的要求。因此必須按照不同培養階段的微生物生理學(xué)特性提供適宜的培養基配方。

      4.1.1.1 碳源對發(fā)酵的影響

      碳源是組成培養基的主要成分之一,其主要作用是供給菌種生命活動(dòng)所需要的能量和構成菌體細胞成分和代謝產(chǎn)物中的碳素來(lái)源。一般的微生物可以在含各種碳水化合物的培養基上良好生長(cháng),但它們產(chǎn)物的生產(chǎn)能力和碳源的種類(lèi)有很大關(guān)系。碳源的種類(lèi)及濃度,主要是由菌種耐滲透壓高低和調節細胞膜滲透性的方法來(lái)決定,所以枯草芽孢桿菌發(fā)酵采用的碳源主要有葡萄糖、糖蜜、淀粉、玉米粉等。目前,國內外主要選用玉米粉。

      4.1.1.2 氮源對發(fā)酵的影晌

      氮源的主要作用是微生物細胞物質(zhì)和含氮代謝物的氮素來(lái)源的營(yíng)養物質(zhì)。氮源作為枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養基的另一個(gè)主要因素,在芽孢的形成上也發(fā)揮著(zhù)重要作用?莶菅挎邨U菌在生產(chǎn)中常用豆餅粉、魚(yú)粉以及(NH4)2S04等一些試劑作氮源。C/N直接影響菌體的生長(cháng)和代謝,碳源轉化為微生物自身的細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物,并且是能源物質(zhì)。氮源是構成微生物細胞蛋白質(zhì)和核酸的主要元素,而蛋白質(zhì)和核酸是微生物原生質(zhì)的主要組成部分。如果C/N偏小,會(huì )導致菌體生長(cháng)過(guò)剩,易造成菌體提前衰老自溶;C/N過(guò)大,菌體繁殖數量少,發(fā)酵密度低,細菌代謝不平衡,不利于產(chǎn)物的積累;C/N合適,但C、N源濃度過(guò)低,則會(huì )影響菌體的繁殖,C、N濃度過(guò)高,則發(fā)酵起始導致菌體大量繁殖,代謝廢物過(guò)多而增加發(fā)酵液的黏度,使溶解氧降低,引起菌體代謝異常,最終也影響產(chǎn)物的合成。

      4.1.1.3 無(wú)機鹽對發(fā)酵的影響

      工業(yè)發(fā)酵中應用微生物的生長(cháng)繁殖和產(chǎn)物合成中都需要無(wú)機鹽和微量元素,如磷、硫、鐵、錳、鈣、鎂等。許多金屬離子對微生物生理活性的作用與其濃度相關(guān),低濃度往往呈現刺激作用,高濃度卻表現出抑制作用。錳是枯草芽孢桿菌生長(cháng)的必需元素,當培養基中缺少Mn2+時(shí),不適合枯草芽孢桿菌的生長(cháng),促進(jìn)芽孢的生成。提高M(jìn)n2+濃度將會(huì )導致培養基成分比例失調,滲透壓升高等一系列變化,從而誘導芽孢生成。

      磷在菌體生長(cháng)、繁殖和代謝活動(dòng)中起著(zhù)極其重要的作用。一方面,磷是構成核酸、磷脂、許多輔酶或輔基(輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ、輔酶A、NAD和NADP等)以及高能磷酸化合物的重要原料,另一方面,磷在代謝調節方面也起著(zhù)重要的作用,磷能促進(jìn)糖代謝的進(jìn)行,促進(jìn)微生物的生長(cháng)。因此,磷源是枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養基中另一個(gè)重要的組成成分,它的濃度直接影響著(zhù)枯草芽孢桿菌菌體的生長(cháng)和芽孢的形成。

      鉀雖不參與細胞結構成分,但它是許多酶作用的激活劑,鉀還對細胞原生質(zhì)的膠體狀態(tài)和細胞膜的透性起調控作用。

      鈣主要參與調節細胞的生理狀態(tài),如:維持細胞的膠體狀態(tài),降低細胞膜的通透性,調節pH等。

      4.1.2 其他發(fā)酵參數對發(fā)酵的影響

      4.1.2.1初始pH對發(fā)酵的影響

      pH是微生物生長(cháng)和產(chǎn)物合成的非常重要的狀態(tài)參數,是代謝活動(dòng)的綜合指標。為了達到微生物的充分繁殖,培養基必須保持適當的pH。初始pH的變化對于枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程影響是非常顯著(zhù)的。因此,決定最佳初始pH對于細菌發(fā)酵液含菌量就顯得尤為重要。

      pH影響菌量的原因:1)pH會(huì )影響微生物的細胞原生質(zhì)膜的電荷,使細胞原生質(zhì)膜發(fā)生變化,引起原生質(zhì)膜對個(gè)別離子滲透性的改變,從而影響到微生物對培養基中的一些營(yíng)養物質(zhì)的吸收利用以及代謝物的滲漏,進(jìn)而影響微生物的生長(cháng)和新陳代謝的正常進(jìn)行。2)pH會(huì )直接影響到微生物細胞內的酶活性,在合適的pH下,微生物細胞內的酶才能發(fā)揮最大的活性;在不合適的pH下,微生物細胞內的某些酶的活性受到抑制,從而影響微生物的生長(cháng)繁殖和新陳代謝。3)pH會(huì )影響到培養基中某些重要的營(yíng)養物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的離解,從而影響微生物對這些物質(zhì)的吸收和利用。

      4.1.2.2溫度對發(fā)酵的影響在發(fā)酵過(guò)程中需要維持生產(chǎn)菌的生長(cháng)和生產(chǎn)的適當發(fā)酵條件,其中之一就是溫度。溫度對微生物生長(cháng)的影響,是綜合影響各種代謝反應的結果。溫度通過(guò)影響微生物膜的液晶結構、酶和蛋白質(zhì)的合成與活性,以及RNA的結構和轉錄,從而進(jìn)一步的影響微生物的生理活動(dòng)。高溫會(huì )使微生物細胞內的蛋白質(zhì)發(fā)生變性或凝固,同時(shí)還破壞了微生物細胞內的酶活性,從而殺死微生物;而低溫又能抑制微生物的生長(cháng)。任何微生物的生長(cháng)都有一個(gè)最適生長(cháng)溫度范圍,在此溫度范圍內,微生物生長(cháng)繁殖最快。溫度過(guò)高過(guò)低,芽孢桿菌生長(cháng)代謝緩慢,營(yíng)養體都難以形成,芽孢則更難以在營(yíng)養體內產(chǎn)生。

      4.1.2.3溶氧對發(fā)酵的影響

      溶氧(Dissolve Oxygen,DO)是需氧微生物生長(cháng)所必需的?莶菅挎邨U菌是好氧細菌,它產(chǎn)孢需要有氧氣的存在。MohamedIsmail等研究過(guò)的球形芽孢桿菌(Bacillusphaerlcus)芽孢形成與溶解氧的關(guān)系一樣,發(fā)現隨著(zhù)溶解氧的濃度升高,芽孢形成量越高。但溶解氧濃度過(guò)高,反而使產(chǎn)孢量下降,這是因為對于好氧枯草芽孢桿菌來(lái)說(shuō),在其他發(fā)酵條件一定的情況下,特別是在對數生長(cháng)期和芽孢形成期,保證足夠的通氣量有利于芽孢的產(chǎn)生,培養基中的溶解氧水平越高越有利于芽孢的產(chǎn)生。但通氣量過(guò)大,溶解氧過(guò)量時(shí),由于菌體自溶反而使芽孢數下降。這與Youset的觀(guān)點(diǎn)相同。研究發(fā)現,芽孢大量出現的時(shí)間均在枯草芽孢桿菌的對數生長(cháng)末期和衰亡期以后的一段時(shí)間,但時(shí)間過(guò)長(cháng),芽孢數便會(huì )穩定在一個(gè)水平之上,符合芽孢形成規律。

      4.1.2.4初始接種量對發(fā)酵的影響

      接種量是指待接種的液體培養基與接入的培養液的體積百分比。由于各級種子培養時(shí)間較短,因此采用大接種量有利于菌體形成群體優(yōu)勢而縮短延遲期。接種量過(guò)小則可能使延遲期延長(cháng),不利于縮短發(fā)酵周期,但接種量過(guò)大也沒(méi)有必要,因為過(guò)大的接種量不但不能縮短延遲期,反而會(huì )帶進(jìn)較多的代謝廢物而不利于培養物的生長(cháng)。不同的微生物由于其生理特性的不同,要求的最適接種量大小也不同。就某種特定的微生物而言,接種量的大小既取決于其自身生理特性,同時(shí)也與培養物中微生物所處的生長(cháng)時(shí)期相關(guān)。

      4.1.2.5裝液量對發(fā)酵的影響

      裝液量的多少直接影響到菌體在生長(cháng)過(guò)程中對氧的獲得能力;同樣搖床轉速下,裝液量少,菌體獲得氧的含量高;裝液量多,則菌體獲得氧的含量低。氧是好氧性微生物不可缺少的營(yíng)養物質(zhì)之一,它參與某些物質(zhì)代謝中的加氧反應。另外,氧是物質(zhì)有氧降解最終的電子受體,在這個(gè)過(guò)程中,產(chǎn)生出微生物進(jìn)行生命活動(dòng)所需要的能量。對好氧性微生物來(lái)說(shuō),必須生長(cháng)在有氧的環(huán)境中,供氧量的多少會(huì )直接影響到其生長(cháng)或代謝作用。

      總之,枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程中,上述的每一個(gè)因素都至關(guān)重要。其中,培養基除具備微生物必要的營(yíng)養要素外,還應具有合適的比例,所以應對發(fā)酵培養基進(jìn)行優(yōu)化。培養基優(yōu)化方法多是在單因素水平試驗的基礎上進(jìn)行正交實(shí)驗設計或是在正交試驗基礎上應用均勻設計理論,或者采用通用旋轉組合設計,均能對培養基優(yōu)化取得較好的效果。在工業(yè)化生產(chǎn)中,還需要對接種量、pH、溫度、轉速、通風(fēng)比、溶氧、以及消泡劑用量等一系列因素進(jìn)行嚴格控制,才能保證枯草芽孢桿菌發(fā)酵活菌數達到最高、發(fā)酵效果最好、在動(dòng)物飼料里的添加效果最理想。

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      沙發(fā)
      發(fā)表于 2020-3-1 22:42:09 | 只看該作者
      fico的非常的好
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